近日，Horticultural Plant Journal正式刊發(fā)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院汪良駒教授團(tuán)隊(duì)題為“MdWRKY71 as a positive regulator involved in 5-aminolevulinic acid-induced salt tolerance in apple（MdWRKY71 作為一個正向調(diào)節(jié)因子參與5-氨基乙酰丙酸誘導(dǎo)的蘋果耐鹽性）”的研究論文。

1. 研究背景：

蘋果屬于中度鹽敏感型果樹，土壤鹽漬化時常困擾著蘋果生長與生存。尤其是，近年來由于肥水管理不當(dāng)引起的土壤次生鹽漬化，嚴(yán)重影響蘋果生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)，因此有效提高蘋果耐鹽性具有社會和經(jīng)濟(jì)重大意義。

5-氨基乙酸丙酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）是一種新型植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。在草莓受到鹽脅迫時，ALA能夠提高植株葉片與根系的抗氧化酶活性，并且誘導(dǎo)Na⁺和Cl⁻截留于根中，從而減少其吸收運(yùn)輸以及在葉片中積累，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)植物耐鹽性的目的。在蘋果上，ALA可以促進(jìn)花青苷合成，進(jìn)而促進(jìn)蘋果著色，而且這一過程經(jīng)由轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY71介導(dǎo)。然而，MdWRKY71能否介導(dǎo)ALA提高蘋果耐鹽性，迄今未見到報道。

2. 研究問題：

探究ALA和MdWRKY71緩解蘋果鹽脅迫傷害效應(yīng)，分析MdWRKY71調(diào)控的下游基因及其在蘋果耐鹽中的作用機(jī)理。

3. 研究結(jié)果：

(1) 將嘎啦蘋果葉片置于在鹽溶液中，24 h時出現(xiàn)葉片鹽傷害癥狀(Fig. 1)。這種傷害程度隨著鹽處理時間延長而加重，葉片失綠，細(xì)胞死亡。若添加外源ALA，則顯著減輕葉片褐化，減少細(xì)胞傷害，緩解鹽脅迫引起的葉綠素含量下降。qRT-PCR檢測顯示，NaCl顯著上調(diào)MdWRKY71表達(dá)，而ALA能進(jìn)一步促進(jìn)MdWRKY71表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，MdWRKY71蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)；GUS染色顯示，MdWRKY71啟動子活性受到NaCl和ALA的顯著誘導(dǎo)，證明這是一個響應(yīng)NaCl和ALA處理的轉(zhuǎn)錄因子。

Fig. 1 ALA promotes salt tolerance of apple leaves and MdWRKY71 is an ALA-responsive transcription factor under salt stress

(2) qRT-PCR檢測顯示(Fig. 2)，蘋果葉片蛋白激酶基因MdSOS2、Na⁺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MdSOS1、MdSOS3和MdNHX1，Cl⁻轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MdCLC-a/b、MdCLC-c1和MdCLC-g以及抗氧化酶基因MdSOD1、MdPOD1、MdCAT1、MdAPX1和MdGR1的表達(dá)均響應(yīng)鹽脅迫刺激，而ALA可以進(jìn)一步促進(jìn)這些基因表達(dá)，暗示ALA提高蘋果耐鹽性可能與其調(diào)控離子平衡和活性氧平衡有關(guān)。

Fig. 2 ALA promotes gene expressions associated with salt tolerance in apple leaves under NaCl stress

(3) 過表達(dá)（OE）-MdWRKY71能顯著減輕鹽脅迫對嘎啦蘋果葉片傷害以及愈傷細(xì)胞生長的抑制，緩解葉綠素含量下降，同時促進(jìn)抗氧化酶（SOD，CAT，APX）活性提高，抑制H₂O₂、O₂^•¯積累和MDA上升；而干擾（RNAi）-MdWRKY71表達(dá)則呈現(xiàn)相反趨勢。ALA顯著增強(qiáng)三種基因型蘋果離體葉片和愈傷細(xì)胞耐鹽性(Fig. 3)，證明ALA可能通過MdWRKY71來增強(qiáng)蘋果抗氧化酶活性，進(jìn)而提高葉片和愈傷細(xì)胞耐鹽性。

Fig. 3 MdWRKY71 is involved in ALA-enhanced salt tolerance of apple

(4) 將OE-MdWRKY71轉(zhuǎn)入煙草，則轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性顯著提高。ALA處理可以提高野升型煙草植株耐鹽性，還能進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性(Fig. 4)。在這過程中，MdWRKY71和ALA緩解鹽脅迫誘導(dǎo)的葉片葉綠素下降，提高葉片相對含水量，抑制Na⁺和Cl⁻含量上升，緩解K⁺和NO₃⁻含量下降。對于根系來說，MdWRKY71和ALA促進(jìn)Na⁺和Cl⁻在根系中積累。這種根系截留鹽離子同時減少葉片積累的特性是MdWRKY71和ALA提高植物耐鹽性的重要機(jī)制。

Fig. 4 OE-MdWRKY71 and ALA treatment improve salt tolerance in tobaccos

(5) LUC和GUS染色顯示，MdWRKY71可結(jié)合（蛋白激酶基因MdSOS2）、離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因（MdNHX1、MdCLC-g）和抗氧化酶基因（MdSOD1、MdCAT1、MdAPX1）啟動子，并上調(diào)基因表達(dá)(Fig. 5)。

Fig. 5 MdWRKY71 binds to the promoters of MdSOS2, MdNHX1, MdCLC-g, MdSOD1, MdCAT1, and MdAPX1 to activate gene expressions

EMSA顯示，MdWRKY71可以特異性結(jié)合MdSOS2、MdNHX1、MdCLC-g、MdSOD1、MdCAT1，MdAPX1啟動子上的W-box (Fig. 6)。

Fig. 6 EMSA analyses show that MdWRKY71 binds to the W-box of the promoters of MdSOS2, MdNHX1, MdCLC-g, MdSOD1, MdCAT1 and MdAPX1

4. 意義和創(chuàng)新性：

本研究報道，外源ALA可以提高蘋果耐鹽性，MdWRKY71表達(dá)可以被鹽脅迫和ALA誘導(dǎo)，并以轉(zhuǎn)錄因子形式作用于Na⁺和Cl⁻運(yùn)輸以及抗氧化酶基因啟動子上游，提高基因轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)鹽離子外排出質(zhì)膜，或區(qū)隔化于液泡內(nèi)。這樣，既避免鹽離子毒害，又作為廉價滲透溶質(zhì)，提高植株吸水能力；同時，由于上調(diào)抗氧化酶基因表達(dá)，酶活性提高，可以清除活性氧自由基。因而，本研究成果從離子毒害和氧化脅迫兩個方面解釋了ALA提高蘋果耐鹽性的機(jī)理，從而為ALA在蘋果耐鹽實(shí)踐中應(yīng)用提供了理論依據(jù)。同時，新挖掘出的MdWRKY71基因可望應(yīng)用于耐鹽蘋果育種實(shí)踐。

作者及其團(tuán)隊(duì)介紹：碩士畢業(yè)研究生李亞格和鐘山青年研究員張留孜為該文共同D一作者，汪良駒教授和仲巖副教授為該文通信作者，碩士畢業(yè)研究生袁舟宇和科研助理張建婷參與本研究。

汪良駒教授是江蘇省植物生理學(xué)會植物生長物質(zhì)與生長調(diào)控委員會主任。他于2000年起開始從事ALA在農(nóng)林作物抗逆增產(chǎn)提質(zhì)增效及其生物學(xué)基礎(chǔ)研究。其研發(fā)的產(chǎn)品“金村秋”、“禾稼春”和“秀果美”等已大面積應(yīng)用于國內(nèi)20多個省市區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)。其團(tuán)隊(duì)先后獲得20多項(xiàng)政府專項(xiàng)資金資助，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊發(fā)表與ALA有關(guān)研究論文100余篇，授權(quán)專利20余項(xiàng)，處于5-A農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究前沿。

基金介紹：該研究獲得自然科學(xué)基金(32230097和32172512)、江蘇省碳達(dá)峰碳中和前沿基礎(chǔ)專項(xiàng)資金(BK20220005)、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新B類項(xiàng)目[CX(20)2023]和江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科等項(xiàng)目的資助。